響應(yīng)面法優(yōu)化制備牡蠣短肽工藝

牡蠣俗稱生蠔、海蠣子，因肉質(zhì)爽滑，味道鮮 美，營養(yǎng)豐富，被附以“根之源”“海洋牛奶”等 美譽(yù)。近年來，我國牡蠣行業(yè)產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年上升 的趨勢，2018 年養(yǎng)殖量達(dá) 513.9 萬 t 。但是目前 國內(nèi)牡蠣的應(yīng)用仍以直接食用或制成調(diào)味料為主， 針對其精深加工技術(shù)與新型產(chǎn)品開發(fā)的進(jìn)展較為 緩慢，因此，推動(dòng)牡蠣深加工及綜合利用對其產(chǎn)業(yè) 的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。一般來說，3 ~ 9 個(gè)氨基酸聚合而成的肽稱為短肽，其相對分子 質(zhì)量范圍為180 ~ 1 000，介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間， 具有吸收好、代謝快、活性高等優(yōu)點(diǎn)，是目前國內(nèi) 外研究開發(fā)的熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis），體質(zhì) 量（20.56 ± 1.34）g，購于湛江市東風(fēng)市場；菠蘿 蛋白酶（1.6×104 U/g）、木瓜蛋白酶（7.0×104 U/g）、 動(dòng)物蛋白酶（6.8×104 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（7.0×104 U/g）、中性蛋白酶（6.3×104 U/g），南寧龐博生物工 程有限公司；Protamex（6.3×104 U/g）、Flavourzyme （5.9×104 U/g），諾維信生物技術(shù)有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH），上海源葉生物有限公司；混合 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；氫氧化 鈉、甲醛等分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-25 雷磁 pH 計(jì)，上海康儀儀器有限公司； UV-8000 紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公 司 ；VAPODEST450 全自動(dòng)凱氏定氮儀，德國 Gerhardt 公司；L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀，日立 高新技術(shù)公司；SHZ-水浴恒溫震蕩器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；冷阱 CT-6、ZLS-1 型真 空離心濃縮儀，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣酶解液的制備

牡蠣全肉經(jīng)流水解凍 后打漿均勻，按料液質(zhì)量體積比（g/mL，下同）1∶ 3 加水，調(diào)各酶最適 pH 值，8 000 r/min 勻漿 2 min， 加酶酶解后 100 ℃水浴滅酶 10 min，靜置冷卻至室 溫后以 8 000 r/min 離心 15 min，最后四層紗布過濾 獲取上清液，在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?br />
1.3.2 高效蛋白酶的篩選

選用 Flavourzyme、 Protamex、動(dòng)物蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、 木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，在各自最適條件下進(jìn)行 酶解（表 1），以水解度、氮 N 回收率、短肽質(zhì)量 濃度、短肽得率為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)酶解效果。

1.3.3 前處理對酶解效果的影響

稱取牡蠣漿液40 g 放入 250 mL 錐形瓶中，按料液比 1∶3 加蒸餾 水后均質(zhì)，分別采用熱處理（60、70、80、90、100 ℃ 下水浴保溫 10 min）和室溫 25 ℃下超聲波處理（功 率 500 W 處理 10、15、20 min，）兩種方式對牡蠣 勻漿液進(jìn)行預(yù)處理，冷卻至室溫測 pH 值后加入動(dòng) 物蛋白酶酶解 4 h，最后 100 ℃水浴滅酶 10 min 離 心取上清液，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶酶解效果分析

風(fēng)味蛋白酶的水解度最高為（41.86 ± 3.62）%，動(dòng)物蛋白酶略低，為（41.37 ± 1.19）%， 兩者無顯著差異（P > 0.05）。中性蛋白酶的 N 回收 率最高為（84.12±2.18）%，動(dòng)物蛋白酶次之為（77.53 ± 0.49）%。由圖 1B 顯示結(jié)果可知，動(dòng)物蛋白酶的 短肽質(zhì)量濃度和短肽得率均顯著高于其他六種蛋 白酶（P < 0.01），分別為（15.68 ± 0.67）mg/mL， 34.79%。不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)千差萬別導(dǎo)致酶解 效果的大不相同，動(dòng)物蛋白酶本身是一種復(fù)合酶， 它既是內(nèi)切酶又是外切酶，具有多種酶切位點(diǎn)，故 其酶解產(chǎn)物各項(xiàng)指標(biāo)利用率高。因此，選取動(dòng)物蛋白酶為酶解牡蠣的高效蛋白酶，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同前處理對酶解效果的影響

熱處理 10 min 后的動(dòng)物蛋白酶 酶解產(chǎn)物水解度和 N 回收率均低于未處理，且隨著 溫度升高，牡蠣酶解產(chǎn)物的水解度和 N 回收率逐步 降低。這可能是因?yàn)榧訜釡囟冗^高或時(shí)間過長，都 會(huì)使已暴露出來的S—H氧化生成S—S或疏水相互 作用導(dǎo)致致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，導(dǎo)致眾多酶切位點(diǎn) 反而被包埋。郭玉華等研究顯示熱處理溫度越 高，牡蠣酶解產(chǎn)物的水解度越低；林海生等研究 表明熱處理組水解度均低于未處理組。本研究結(jié) 果與其結(jié)論相一致。圖 2A 顯示，酶解產(chǎn)物在 500 W 條件下超聲 10、15、20 min 后的水解度和 N 回收 率均低于未處理組。這可能是 500 W 超聲波過強(qiáng)且 超聲波過程中產(chǎn)熱導(dǎo)致牡蠣蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，致 使蛋白酶酶解效率降低。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定牡蠣勻漿液經(jīng) 80 ℃熱處理 10 min后加動(dòng)物蛋白酶為制備牡蠣短肽的高效方法。確定 最佳酶解工藝條件,即料液比 1∶3.9，酶解溫度 47 ℃，動(dòng)物蛋白酶加酶量 3 300 U/g，自然 pH 下 酶解時(shí)間 3 h，此條件下短肽得率達(dá)（58.53 ± 1.20）%，比傳統(tǒng)工藝的短肽得率提升 24.8%。該回 歸模型可靠，說明利用響應(yīng)面法能有效優(yōu)化制備牡 蠣短肽的酶解工藝。



 

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