結(jié)構(gòu)域PKS/NRPS基因的克隆(博迅培養(yǎng)箱使用)

球孢白僵菌 Beauveria bassiana 是一種可寄生在多種昆蟲(chóng)上具較強(qiáng)致病性的真菌， 已被廣泛用作防 治森林、 農(nóng)作物蟲(chóng)害的生物農(nóng)藥 ； 它產(chǎn)生大量如非核糖體多肽、 聚酮類(lèi)等次生代謝產(chǎn)物， 可抑制多 種腐生或寄生線蟲(chóng) 。 聚酮、 非核糖體多肽及其雜合化合物如聚酮中的紅霉素 、 四環(huán)素； 非核糖體 多肽中的青霉素、 頭孢霉素 ； 聚酮和非核糖體多肽的雜合化合物如他克莫司、 雷帕霉素 、 博來(lái)霉 素 、 埃博霉素等具有免疫抑制劑或抗腫瘤等生理活性。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)條件

昆蟲(chóng)致病真菌球孢白僵菌（菌株號(hào)： YH02）來(lái)源于云南云百草生物技術(shù)有限公司， 將 YH02 菌株接 種在 MY 固體培養(yǎng)基（malt/yeast extract medium）上， 置于 25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)， 每隔 2 周轉(zhuǎn)接 1 次； 用 于基因組 DNA 和總 RNA 提取的真菌接種于液體 MY 培養(yǎng)基中， 置于 120 r·min－1 和 25 ℃條件下培養(yǎng) 5~7 d 后， 收獲約 0.5 g 菌絲體， 用吸水紙徹底吸干后在液氮環(huán)境下用研缽研磨成粉末用于基因組 DNA 和 總 RNA 的提取。 MY 培養(yǎng)基的具體配方麥芽糖 6.0 g·L－1 ， 酵母提取物 4.0 g·L－1 ， 固體培養(yǎng)基配置時(shí)加 20.0 g·L－1 瓊脂。

1.2 試劑與器材

試驗(yàn)涉及試劑包括： 真菌基因組 DNA 提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）， 高保真聚合 酶、 真菌總 RNA 提取試劑盒（大連寶生物工程公司）， 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）， 無(wú)縫 克隆試劑盒（Biomiga）。 主要使用儀器為 NanoDropTM 2000 紫外分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技有限公司）、 Azure C300 凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems）、 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、 多功能組合搖床（江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）。

1.3 Bbpks2 基因的挖掘及克隆

首先以曲霉中已報(bào)道過(guò)的 PKS 基因?yàn)槟０澹?利用本地 BLAST（basic local alignment search tool）對(duì)球 孢白僵菌基因組進(jìn)行掃描， 獲得可能含有 PKS 基因的重疊群（contigs）， 然后利用 antiSMASH（https://antismash.secondarymetabolites.org/）軟件進(jìn)行驗(yàn)證， 并利用 GENEFISH 對(duì)重疊群進(jìn)行開(kāi)放閱讀框掃描， 通過(guò) 生物信息學(xué)分析獲得白僵菌基因組中 Bbpks2 基因的 DNA 序列。 根據(jù) DNA 序列設(shè)計(jì) 2 對(duì)特異引物（Bbpks25F： 5′-ATGTCTTCGCACCAAAACGA-3′； Bbpks2MR： 5′- AACAGCACTGTCACTGTCCAC-3′ ； Bbpks2MF： 5′ -AACGCTGGCTATAATGCTCTT-3′ ； Bbpks23R： 5′ - GGCTTCCTGGAGCGGTAA-3′）用于 Bbpks2 基因全長(zhǎng) cDNA 的克隆。 以球孢白僵菌的 cDNA 為模板， 用 HiFi 高保真酶分別擴(kuò)增出 Bbpks2 基因的 5′片段和 3′片段， 經(jīng) DNA 純化試劑盒將這 2 個(gè)片段純化后， 按照無(wú)縫克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)中的具體步驟將 Bbpks2 基因的 5′片段和 3′片段連接起來(lái)， 獲取全長(zhǎng) cDNA。 將該基因片段連接到克隆載體 Peasy-T3 上， 轉(zhuǎn)化到 Trans-T1 感受態(tài)細(xì)胞中， 進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后， 通過(guò) 菌落 PCR 篩選含有插入片段的陽(yáng)性克隆送到上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.4 聚類(lèi)分析方法

從美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）上選擇功能已知且鑒定過(guò)化合物的 PKS/NRPS 蛋白序列， 包括黃曲 霉 Aspergillus flavus， 米曲霉 A. oryzae 中編碼環(huán)匹阿尼酸（cyclopiazonic acid）生物合成的 CpaA 基因 （BAI43678， BAG82673）， 擴(kuò)展青霉 Penicillium expansum 中編碼球毛殼甲素（chetoglobosin A）生物合成 的 CheA 基因（CAO91861）， 棒曲霉 A. clavatus 中編碼細(xì)胞松弛素 E（cytochalasin E）生物合成的 CcsA 基 因 XM_001270542， 異孢鐮刀菌 Fusarium heterosporum 中編碼伊快霉素（equisetin）的 EqiS 基因（Q5SBL2）， 水稻惡苗病菌 Fusarium fujikuroi， 串珠赤霉菌 Gibberella moniliformis 及假禾谷鐮孢菌 Fusarium pseudograminearum 等 真菌 中 編 碼鐮 刀 菌素 C（fusarin C）生物 合成的 FusA（AFP73394） ， FusS （AAT28740） ， pks10（EKJ71911）等基因， 煙曲霉 Aspergillus fumigatus 中編碼假散囊菌素 A（pseurotin A）的 PsoA 基因 （ABS87601）， 球孢白僵菌中編碼卵孢白僵菌素（tenellin）的 TenS 基因（XP_008600657）等蛋白序列用于聚 類(lèi)分析， 采用 MEGA 7.0 中的 Clustal W 程序?qū)λx擇的 PKS 蛋白序列和球孢白僵菌中的 BbPKS1 蛋白 序列進(jìn)行比對(duì)后， 采用鄰位相接法（neighbor-joining）， 自檢舉 1 000 次， 其余采用默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn) 化樹(shù)。 依據(jù)聚類(lèi)結(jié)果， 從基因起源與功能分化的角度預(yù)測(cè)該基因功能， 并進(jìn)一步推測(cè)該基因產(chǎn)生的聚酮 化合物。

1.5 Bbpks2 基因在不同培養(yǎng)基上的表達(dá)

根據(jù)分離得到的 Bbpks2 基因的 DNA 序列， 設(shè)計(jì)特異檢測(cè)引物（TBbpks2F： TCTCCTTGGCAAGGTTACTG； TBbpks2R： ACCACGCTCCATCATGTACT）。 然后將球孢白僵菌培養(yǎng)在添加不同碳源、 氮源的培 養(yǎng)基上。 不同碳源實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 6.0 g·L－1 麥芽浸粉， 3.0 g·L－1 酵母提取物， 分別添加 4.0 g·L－1 乳 糖、 甘露醇、 麥芽糖、 葡萄糖、 山梨醇、 果糖、 肌醇； 不同氮源實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 1.8 g·L－1 麥芽糖， 6.0 g·L－1 葡萄糖， 分別添加 4.0 g·L－1 牛肉浸粉、 酪蛋白胨、 胰蛋白胨、 馬鈴薯。 培養(yǎng) 14 d 后， 從每種 培養(yǎng)基上收獲 0.5 g 菌絲體， 采用真菌總 RNA 提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)步驟提取各自的總RNA， 并選擇濃 度合適的 RNA 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA， 再用特異引物 TBbpks2F 和TBbpks2R 檢測(cè)該基 因的表達(dá)情況。 在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)過(guò)程中， 各 PCR 產(chǎn)物和 1 kb DNA marker 的點(diǎn)樣量均為 2.5 μL， 電泳結(jié)束后， 利用 Azure C300 凝膠成像系統(tǒng)自帶的圖像分析軟件分析各條帶的積分光密度， 比較各 PCR 產(chǎn)物條 帶的積分光密度值， 并以該值與 1 kb marker 的條帶進(jìn)行比較作為相對(duì)表達(dá)量繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)無(wú)縫克隆獲得 Bbpks2 基因的全長(zhǎng) cDNA。 分析顯示： Bbpks2 基因全長(zhǎng) 12 051 bp， 編碼 4 016 個(gè) 氨基酸； 經(jīng)過(guò)序列相似性及保守結(jié)構(gòu)域的分析顯示， 該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域組織順序?yàn)?KS-AT-DHMT-KR-ACP-C-A-PP-SDR； 該蛋白同時(shí)含有 PKS 和 NRPS 酶蛋白的結(jié)構(gòu)域， 由此推斷該蛋白是一種 PKS/ NRPS 酶蛋白復(fù)合體。該聚類(lèi)樹(shù)可 分為 4 個(gè)較大的亞類(lèi)（分支Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ， Ⅳ）， 各個(gè)亞類(lèi)間的結(jié)構(gòu)域組織順序存在差異， 至少存在 1 個(gè)結(jié) 構(gòu)域的不同； 鐮刀菌屬 Fusarium 真菌中編碼伊快霉素、 不同真菌中參與編碼細(xì)胞松弛素 E 的酶蛋白聚 到同一分支上， 且二者親緣關(guān)系明顯較近。 球孢白僵菌的 BbPKS2 蛋白與這 2 類(lèi)酶蛋白被歸類(lèi)到分支Ⅱ 中， 該亞類(lèi)的結(jié)構(gòu)域組織順序?yàn)?KS-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-PP-SDR； BbPKS2 與球孢白僵菌 JEF007 菌 株（PMB64475.1）、 頭狀蟲(chóng)草 Tolypocladium capitatum（PNY25600.1）聚在一個(gè)亞分支中； 推測(cè) BbPKS2 蛋 白所參與合成的天然次生代謝產(chǎn)物與伊快霉素、 細(xì)胞松弛素 E 存在一定的結(jié)構(gòu)相似性。

3 討論

球孢白僵菌主要是在機(jī)械壓力和酶共同作用下侵染昆蟲(chóng)寄主 ， 在昆蟲(chóng)體內(nèi)通過(guò)次生代謝途徑中相 關(guān)酶類(lèi)所產(chǎn)生的毒素致死寄主 。 但該真菌次生代謝途徑中所產(chǎn)生的毒素除少數(shù)外， 尚有大量的次生代 謝產(chǎn)物生物合成基因未與相關(guān)化合物關(guān)聯(lián)。 結(jié)合基因組挖掘技術(shù)和一菌多產(chǎn)物策略（one strain many compounds， OSMAC）、 異源表達(dá)等操作技術(shù)可促進(jìn)該問(wèn)題的解決， 從真菌基因組數(shù)據(jù)中可大量挖掘得 到 PKS， NRPS 等生物合成基因， 通過(guò)序列相似性、 結(jié)構(gòu)域、 基因片段的大小及聚類(lèi)分析等初步推斷該 基因的功能， 初步了解該酶所參與合成化合物的某些結(jié)構(gòu) 。 如編碼 2-吡啶酮卵孢白僵菌素（2-pyridone tenellin）酶蛋白的 PKS/NRPS 基因約 12.9 kb ， 編碼鐮刀菌素 C 酶蛋白的 fusA 基因（PKS/NRPS）約 11.9 kb ； BALI 等 在大腸埃希菌 Escherichia coli 中過(guò)量表達(dá)其 SDR 等末端釋放結(jié)構(gòu)域， 發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu) 域?qū)Y(jié)構(gòu)中含有環(huán)己酮的底物具較高活性。 同時(shí)因本研究中的 Bbpks2 基因尚未發(fā)現(xiàn)有較高同源性基因 存在， 通過(guò)結(jié)構(gòu)域分析推測(cè)該基因所編碼的酶蛋白屬于 PKS/NRPS， 參與聚酮/非核糖體多肽的生物合 成， 且該化合物與伊快霉素、 細(xì)胞松弛素 E 存在某些共同的結(jié)構(gòu)； 通過(guò)比較分析伊快霉素、 細(xì)胞松弛素 E， 綜合分析該化合物可能含吡咯烷酮結(jié)構(gòu)。



 

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